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细胞凋亡

细胞凋亡通常称为细胞程序性死亡,是由基因控制的主动性细胞死亡过程。越来越多数据发现,细胞凋亡与多种疾病密切相关,如癌细胞具有连续增殖、抵抗细胞凋亡能力,利用流式细胞仪分析细胞凋亡可为肿瘤诊断,疗效评价和预后预测提供了重要的参考指标。

细胞凋亡(apoptosis)是一件主动性细胞死亡事件,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控,是细胞为更好地适应环境而主动争取的一种死亡过程。具体表现为:出芽形成凋亡小体、核小体间DNA的切割,凋亡小体被吞噬和消化等几个连续过程等。


细胞凋亡与坏死

一、流式检测细胞凋亡的原理

Annexin V和PI双染法是流式检测细胞凋亡的经典方法,该方法简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞,具体原理如下:

Annexin Ⅴ(膜联蛋白 V)是一种分子量为35-36 kDa的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力结合,将Annexin V 进行荧光素FITC标记,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶(Propidium, PI)是一种可与DNA结合的染料,它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。

因此,将Annexin V与PI联合使用时,便可用来鉴别活细胞,凋亡细胞及死亡细胞。

二、实验操作步骤

收集细胞:取适量的对数生长期细胞接种于6孔板中,在相应的条件下(如药物)处理相应时间后,收集细胞,注意要合并上清和消化下来的细胞(注:悬浮细胞直接离心即可);

清洗细胞:用预冷的PBS洗2遍细胞;

分组:每一次实验分为不染组、单染Annexin V组、单染PI组以及PI和Annexin V双染组,处理组按从低到高进行双染;

染色:用PBS把4×binding buffer稀释到1×缓冲液,吸净离心管残余的PBS后,每管加入100μL的1×的binding buffer,用移液枪吹打细胞使细胞充分重悬,避光条件下加入染料。不染组不加,单染组加Annexin V或PI 5μL,Annexin V和PI双染组加入Annexin V 和PI各5μL,并用移液枪轻轻混匀;

上机检测:室温避光孵育15分钟后,加入1×的binding buffer 300μL并混匀后避光下将细胞悬液转移到5mL的流式管中,1h内在流式细胞仪上机检测。


细胞凋亡

左图为Annexin/PI双染法测凋亡,左下象限为活细胞,右下象限为早期凋亡细胞(早期凋亡细胞外翻的PS 能和探针Annexin V特异性结合),右上为晚期凋亡和坏死细胞,左上为彻底死亡的细胞。右图为JC-1染色检测 凋亡,选择绿色FITC和红色PE通道检测JC-1荧光,正常细胞膜电位正常,JC-1为多聚体状态发红光,细胞发生 凋亡时,线粒体膜电位去极化,JC-1变成单体状态发出绿色的光,通过红光和绿光的偏移反应线粒体的膜电位变化。

更多实验技巧请点击实验指南

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